¿Cómo se prepara un homogenato?

septiembre 6, 2021by Kalstein
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La mezcla cruda de células destruidas se conoce con el nombre de homogenato. Durante la centrifugación de un homogenato de células, las partículas más grandes se sedimentan más rápido que las pequeñas, lo que permite obtener fracciones de orgánulos crudos por medio de la centrifugación diferencial.

El primer paso en cualquier proceso analítico en el cual el contenido celular deba ser liberado, consiste en la homogeneización de tejidos y la rotura de celular. Esto nos proporciona una mezcla cruda que se puede utilizar como material de partida en procesos analíticos, o para la determinación de actividades enzimáticas o estudios metabólicos cuando la incorporación de un determinado metabolito por el tejido intacto sea difícil. También podemos usar otros tejidos homogeneizados para la separación de los componentes celulares (fraccionamiento celular), en experimentos de compartimentación metabólica (determinar en qué parte de la célula se produce un proceso o ruta metabólica).

¿Qué debemos tener en cuenta al preparar un homogenato?

El material biológico que se va a homogeneizar se debe seleccionar de modo que sea rico en los orgánulos de interés, y además muy activo en la vía metabólica que se va a estudiar.

Por ejemplo, si queremos estudiar la cadena respiratoria, seleccionaremos un tejido rico en mitocondrias, como el hígado fresco. Si quisiésemos aislar núcleos, tomaríamos un trozo de timo. Además tenemos que tomar la precaución especial de que la solución en la que se lleva a cabo la homogeneización debe ser isotónica (generalmente disoluciones de sacarosa). El fraccionamiento celular se hace mediante centrifugación diferencial (a diferentes velocidades y durante tiempos distintos), así es posible separar núcleos, cloroplastos, lisosomas, mitocondrias, microsomas. El contenido del citosol permanece en el sobrenadante de la última centrifugación.

Muchas enzimas y proteínas son termolábiles (se desnaturalizan por acción de la temperatura) por lo tanto estos procesos de homogeneización deben realizarse en frío (generalmente a 4 ºC en cámaras frías).

¿Qué métodos emplear para preparar un homogenato?

Los métodos empleados para la disyunción de las células se basan fundamentalmente en que en general, las células cultivadas son fáciles de romper. Esto se consigue por choque osmótico, ciclos de congelación–descongelación, o por digestión con enzimas (proteasas y lipasas).

Otra manera de romper las células animales es el caso de disolventes orgánicos como el tolueno . sin embargo, levaduras y células vegetales poseen un pared celular resistente y dura que requiere que para romperla se combinen métodos encimáticos y mecánicos. Los métodos encimáticos implican el tratamiento de las células vegetales con pectinasas y celulasas. En el caso de levaduras su pared se rompe con la lisocima (mezcla de enzimas).

Entre los métodos físicos tenemos:

  • Molido con mortero (en presencia de un agente abrasivo como alúmina).
  • Agitación en presencia de pequeñas bolas de vidrio (es muy usado en levaduras, pero en las plantas se pueden dañar los orgánulos).

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