La medición de la intensidad, el espectro, la vida útil y la polarización de la fluorescencia permite determinar la presencia de fluoróforos y sus concentraciones. El equipo utilizado es llamado fluorómetro, es un instrumento analítico diseñado para la determinación de la concentración de compuestos fluorescentes. La técnica de análisis es denominada de fluorometría, esta es ampliamente aceptada en el ámbito científico, es una valiosa y potente herramienta analítica, tanto para el análisis cuantitativo como para el cualitativo. Es una técnica de emisión óptica sensible, consiste en excitar las moléculas de muestra con una fuente de fotones. La fluorometría aún está en exploración, los instrumentos modernos ofrecen múltiples ventajas que facilitan la obtención de datos. Se utiliza generalmente si no existe un método colorimétrico suficientemente sensible o selectivo para la sustancia a determinar.
Beneficios de emplear el fluorómetro
- La sensibilidad: la mayoría de los analitos permiten un índice de detectabilidad de partes por trillón, el límite de detección depende en gran medida de la muestra que se mide. Esta característica permite la detección utilizando pequeñas cantidades de muestra. La fluorometría debido a su alta sensibilidad, se utiliza para cuantificar el ADN, el ARN y el PCR, permite detectar la contaminación del ADN en los medicamentos y realizar ensayos de vitaminas para procedimientos farmacéuticos.
- La especificidad: los fluorómetros son altamente específicos porque son los compuestos objetivos los que absorben y emiten luz, por lo que son menos susceptibles a interferencias de otros agregados presentes en la muestra. Este instrumento permite identificar la presencia y la cantidad de moléculas específicas en un medio.
- Linealidad en el rango de concentración: La intensidad de la fluorescencia suele ser directamente proporcional a la concentración del absorbente. Las concentraciones de desconocidos se pueden cuantificar matemáticamente frente a la intensidad fluorescente de las biomoléculas conocidas dentro del ensayo. Los fluorómetros modernos pueden detectar concentraciones de moléculas fluorescentes tan bajas como 1 ppt, el rango de longitud de onda operativo del fluorómetro depende de los requisitos del experimento.
- Simplicidad y velocidad de respuesta: la sensibilidad y la especificidad del fluorómetro permite reducir protocolos experimentales para la preparación de muestras que para otros métodos de análisis son rigurosos. Es por esta razón que la fluorometría es una técnica analítica relativamente simple y permite que el análisis sea sencillo, práctico y tenga una rápida respuesta.
- Económico: los costos asociados a los reactivos y la instrumentación son bajos, en relación con otras técnicas de análisis. La fluorometría es una técnica poderosa que se utiliza para una variedad de aplicaciones ambientales, industriales, de diagnóstico, de secuenciación de ADN, análisis forense, genético y biotecnológico. El fluorómetro es un dispositivo que se puede encontrar en diversas presentaciones que permite que se ajusten a la demanda propia de la investigación.
Fluorómetros de filtros
El dispositivo tiene una fuente de excitación, filtros, celdas de muestra y detectores de fluorescencia. Los fluorómetros de filtro poseen una configuración de un solo haz, con control de intensidad de la fuente para reducir los efectos de las fluctuaciones en la respuesta del detector. Estas fuentes pueden producir una radiación intensa de 254 nm, la fuente de luz más común son las lámparas de arco de xenón. La selección de la longitud de onda de excitación se realiza insertando un filtro primario en el haz incidente con esto se obtiene un espectro con buena pureza espectral.
El fluorómetro de filtro es una buena opción cuando se desean mediciones cuantitativas sensibles para compuestos específicos. Este dispositivo proporciona una medición relativa y puede calibrarse con un estándar de concentración conocido o correlacionarse con otros métodos de laboratorio. Los instrumentos modernos basados en microprocesadores ofrecen variedad posibilidades de manipulación de datos a través del software. Incluyen opciones de procesamiento y visualización de datos, sustracción de señal en blanco, espectros derivados, filtrado de espectros, detección de picos, estadística de parámetros.
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